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胶乳微球使用中常见问题及解答
发布日期:2018/12/3      浏览:1291

问:产品说明书中给出的胶乳粒径是平均粒径吗?

答:产品说明书中给出的胶乳粒径(Diameter)是平均粒径。

问:如何选择胶乳微球的粒径?

答:一般选择粒径小的胶乳微球,则需要的抗体量就多,精密度和线性相对较好,而选择粒径大的胶乳微球性,则所需抗体少,精密度和线性相对较差,相对于小球,大球的灵敏度较好。

问:一般情况下我们所使用的微球的浓度大概是多少?

答:整个测定体系中,微球的浓度大约在0.01%左右,当然这与试剂本身规定的线性有关系。

问:在使用离心方法偶联乳胶微球,一般需要多大的(相对)离心力?

答:需要多大的离心力和所使用的乳胶微球有关,一般70nm左右的微球大概13000g/min 30min以上,粒径越小所需时间越长,离心力越大。

问:蛋白(抗体)与微球偶联前,是不是微球的活化时间越长,效率越好?

答:羧基微球的活化所需时间很短,一般以10-20分钟为宜,长时间的活化反而会降低偶联效率。

问:由于抗体不只是FC的氨基酸上有NH2,是不是表示它可以在任何方向与EDCA活化微球偶联呢?如果是这样,是不是会影响抗体与抗原的特异性反应?

答: 事实的确如此,当然由于抗体的空间折叠方式和FC端疏水性强,因此偶联反应的绝大多数发生在Fc端,对抗体与抗原的结合的影响不大。

问:胶乳微球与抗体偶联后,当时没发现有凝集,但隔夜后发现有凝集,这是什么原因?如何控制和避免?

答:这种情况一般是偶联效率低的原因。当体系中蛋白不足或是其它原因,使微球表面在交联后还空出许多反应基团时,这些基团又可以与相连微球上的蛋白反应,结果是把球又拉在一起了,所以有聚集。可以加一些阻断剂 解决,常见的是BSA,另外,也可提高微球的交联率。但为什么是过一段时间后才出现凝集呢,这是因为微球偶联上蛋白后,相互之间由于携带同种电荷的关系,比较稳定(所以能以胶体样存在),只有当偶尔相互碰撞,遇上彼此的反应基团时才能结合。

3、胶乳的自凝现象如何控制和避免?

答:胶乳自凝与许多因素有关,如高电解质浓度、表面价电荷被中和、或置于某些不利环境如冷冻时。如果电解质浓度升高到某一水平,使得表面的价负荷被掩蔽,胶乳微球之间发生接触,于是便产生凝集,故高离子强度的缓冲溶液不应使用,缓冲溶液的的浓度不要超过50mM,但有些CML胶乳微球具有高电荷密度,则也能够耐受较高的离子强度。对负电荷胶乳微球,不能使用阳电荷的缓冲溶液如Tris缓冲溶液,因为能使电荷中和而凝集。在长期贮藏时,悬浮介质的pH值应至少保持在比胶乳微球表面基团的pKa值高1-2pH单位。高浓度的胶乳微球容易促使胶体不稳定,故胶乳微球的浓度尽量以低浓度为宜,胶乳微球也不能受冷冻,否则会凝集。

问:抗体偶联至羧基微球后,即时检测效果很好,但置于37 2天后,抗体活性似乎下降很大,什么原因?

答:这种情况大概是以下情况所致:一、乳胶微球含有表面活性剂,导致胶乳自身出现自凝现象,可以通过显微镜进行观察,如果是胶乳含有活性剂,则在偶联之前进行清洗,保证偶联的胶乳微球没有聚集。二、如果共价结合反应是成功的而抗体活性失活如此迅速,最常见的原因是抗体质量差或试剂过期所致,而且还会出现一个自由流动白色粉末、持续性团块等,这表表明试剂已被污染。

问:胶乳溶液用什么缓冲液多大离子强度保存稳定性最好?

答:一般常用的是低浓度的Goods缓冲液,如MOPSO、MES、HEPES等缓冲液,浓度在25-50mmol/L。

问:胶乳微球偶联抗体后与抗原进行反应,但是反应不明显,是什么原因所致?

答:⑴抗原和抗体不匹配;⑵包被的抗体量下足;⑶抗体使用量虽多,但偶联效率低。

问:如何选择胶乳试剂的波长?

答:胶乳试剂随着检测波长的增加吸光度降低,为了保证试剂检测过程中不超过吸光度的检测限,一般胶乳试剂的波长选择在546-600nm左右。

微球表面基团种类及其反应

微球表面基团

活化剂

与之反应之基团

生成化学键类型

羧基

EDC;EDC/(sulfo)NHS;

CDI;CMPI

伯氨;仲氨

酰胺;仲胺

氨基

交联剂

硼氢化氰

羟基琥珀酰亚胺酯;醛基

卤乙酰基;氯甲基酯

酰胺;仲胺或叔胺

酰肼

交联剂

硼氢化氰

羟基琥珀酰亚胺酯

醛基

二酰基肼

还原型腙

环氧基

 

氨基;巯基;羟基

仲胺;硫醚;醚

醛基

硼氢化氰;苯胺

酰肼;肼;氨氧基

腙;腙;肟

巯基

交联剂;四硫磺酸钠

4,4'-联吡啶二硫醚

马来酰亚胺;卤乙酰基;二硫吡啶;;环氧基;羟基琥珀酰亚胺酯;乙烯砜

硫醚;硫醚;二硫化物

二硫化物;硫醚;硫醚

硫醚

羟基

CDI;对甲苯磺酰氯

溴化氰;DSC

双环氧基化合物

氨基;巯基;羟基

胺;仲胺;硫醚;醚

金属基

硫醇或二硫醇

 

 

硅羟基

硅烷

 

 

 

共价结合胶乳微球的参考方法(以下内容均为国外文献翻译过来的)

A. 一步法

1. 配制50 mM 的MES反应缓冲溶液,pH值为6.0;

2. 将蛋白质溶解于反应缓冲溶液中,其浓度为10mg/ml;

3. 用反应缓冲溶液稀释胶乳微球,使其浓度为1%(W/V);

4. 将上述蛋白质溶液与胶乳微球混和,混和后在室温培育20分钟;

5. 用去离子水配制EDAC溶液,浓度为10 mg/ml(52μmol/ml);

6. 取计算量的EDAC溶液加到蛋白质与胶乳微球混合液中;

7. 用0.1 M氢氧化钠(NaOH)溶液调整该反应混合液的pH值至 6.5±0.2,在摇床室温培育2小时;

8. 将未结合的蛋白质除去,贮藏于缓冲溶液中。

B. 二步法

简单二步法

1. 用反应缓冲溶液稀释胶乳微球,使其浓度为1%(W/V);

2.1ml胶乳微球悬浮液,加入20 mg EDAC,在室温培育40分钟,在20分钟后第二次加入20 mg/ml;

3.用相等体积的该缓冲溶液来洗涤胶乳微球,离心,用1倍体积的缓冲溶液重复处理;

4.将蛋白质溶解于50-100mM的MES缓冲溶液中,蛋白质浓度为1mg/ml;

5.再将胶乳微球悬浮于去离子水或结合的缓冲溶液中,迅速加入溶解的蛋白质,37℃搅拌反应3小时;

6.按1ml反应混合液加入2.5 μl乙醇胺混合,搅拌反应10分钟;

7.除去未结合的蛋白质,贮藏与贮存的缓冲溶液中。

生成NHS-酯的中间体二步法

1.每ml反应混合物加入下列各物:

a.去离子水是最后容积为1.0 ml;

b.0.1 ml的10x的贮备缓冲溶液,其pH值为6.0-6.5(一般可用0.5 M MES缓冲溶液);

胶乳微球最终浓度为1%(W/V);

c.0.23 ml的50 mg/ml 的NHS在去离子水中的溶液;

d.19.2 mg/ml (100 mM)的EDAC在去离子水中的溶液(注5、6);

2.在室温将此混合物反应15-30分钟,不断搅拌;

3.用MES缓冲液或纯化水洗涤胶乳微球悬浮物,除去未反应的NHS和EDAC;

4.重新将胶乳微球在去离子水中悬浮,使其浓度为1%(w/v);

5.将结合的蛋白质溶于50-100mM 的MES缓冲溶液中,浓度为1 mg/ml;

6.立即加入蛋白质溶液(胶乳微球、蛋白质和缓冲溶液的浓度分别为0.5%(w/v)、0.5 mg/ml、25-50 mM);

7.将混合物反应至少2小时,轻轻搅拌;

8. 按1ml反应混合液加入2.5 μl乙醇胺混合,搅拌反应10分钟;

9.除去未结合的蛋白质和乙醇胺,贮与适宜的贮存缓冲溶液中。

C、蛋白质与带醛基的胶乳微球反应

带醛基的胶乳微球是疏水性的胶乳微球,能吸附并能与蛋白质在中性pH条件下生成Schiff碱,这是脂肪族醛基与蛋白质的氨基发生的反应(赖氨酸的伯胺)。这些胶乳微球不需事先活化而生成共价链。Schiff碱的生成是可逆反应。此Schiff碱能被氰基氢硼化钠(sodium cyanoborohydride)反应还原至稳定的烷基胺。当肽类或其他有单一反应氨基的分子与带醛基的胶乳微球结合时,由于还原而趋向稳定。

下面说明蛋白质与带醛基的胶乳微球结合的方法:

1. 配制50 mM的反应缓冲溶液,pH值为7.0-7.5;

2. 配制10 mg/ml的蛋白质在反应缓冲溶液中的溶液;

3. 配制1%(w/v) 带醛基胶乳微球在反应缓冲溶液中的悬浮液;

4. 将1份蛋白质溶液和10份胶乳微球悬浮液混和,在室温反应2小时;

5. 除去未结合的蛋白质;

6. 贮藏胶乳微球结和物与适宜的贮存缓冲溶液中。

 
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