问：产品说明书中给出的胶乳粒径是平均粒径吗？

答：产品说明书中给出的胶乳粒径（Diameter）是平均粒径。

问：如何选择胶乳微球的粒径？

答：一般选择粒径小的胶乳微球，则需要的抗体量就多，精密度和线性相对较好，而选择粒径大的胶乳微球性，则所需抗体少，精密度和线性相对较差，相对于小球，大球的灵敏度较好。

问：一般情况下我们所使用的微球的浓度大概是多少？

答：整个测定体系中，微球的浓度大约在0.01%左右，当然这与试剂本身规定的线性有关系。

问：在使用离心方法偶联乳胶微球，一般需要多大的（相对）离心力？

答：需要多大的离心力和所使用的乳胶微球有关，一般70nm左右的微球大概13000g/min 30min以上，粒径越小所需时间越长，离心力越大。

问：蛋白（抗体）与微球偶联前，是不是微球的活化时间越长，效率越好？

答：羧基微球的活化所需时间很短，一般以10-20分钟为宜，长时间的活化反而会降低偶联效率。

问：由于抗体不只是FC的氨基酸上有NH2，是不是表示它可以在任何方向与EDCA活化微球偶联呢？如果是这样，是不是会影响抗体与抗原的特异性反应？

答： 事实的确如此，当然由于抗体的空间折叠方式和F_C端疏水性强，因此偶联反应的绝大多数发生在Fc端，对抗体与抗原的结合的影响不大。

问：胶乳微球与抗体偶联后，当时没发现有凝集，但隔夜后发现有凝集，这是什么原因？如何控制和避免？

答：这种情况一般是偶联效率低的原因。当体系中蛋白不足或是其它原因，使微球表面在交联后还空出许多反应基团时，这些基团又可以与相连微球上的蛋白反应，结果是把球又拉在一起了，所以有聚集。可以加一些阻断剂 解决,常见的是BSA，另外，也可提高微球的交联率。但为什么是过一段时间后才出现凝集呢，这是因为微球偶联上蛋白后，相互之间由于携带同种电荷的关系，比较稳定（所以能以胶体样存在），只有当偶尔相互碰撞，遇上彼此的反应基团时才能结合。

3、胶乳的自凝现象如何控制和避免？

答：胶乳自凝与许多因素有关，如高电解质浓度、表面价电荷被中和、或置于某些不利环境如冷冻时。如果电解质浓度升高到某一水平，使得表面的价负荷被掩蔽，胶乳微球之间发生接触，于是便产生凝集，故高离子强度的缓冲溶液不应使用，缓冲溶液的的浓度不要超过50mM，但有些CML胶乳微球具有高电荷密度，则也能够耐受较高的离子强度。对负电荷胶乳微球，不能使用阳电荷的缓冲溶液如Tris缓冲溶液，因为能使电荷中和而凝集。在长期贮藏时，悬浮介质的pH值应至少保持在比胶乳微球表面基团的pKa值高1-2pH单位。高浓度的胶乳微球容易促使胶体不稳定，故胶乳微球的浓度尽量以低浓度为宜，胶乳微球也不能受冷冻，否则会凝集。

问：抗体偶联至羧基微球后，即时检测效果很好，但置于37度 2天后，抗体活性似乎下降很大，什么原因？

答：这种情况大概是以下情况所致：一、乳胶微球含有表面活性剂，导致胶乳自身出现自凝现象，可以通过显微镜进行观察，如果是胶乳含有活性剂，则在偶联之前进行清洗，保证偶联的胶乳微球没有聚集。二、如果共价结合反应是成功的而抗体活性失活如此迅速，最常见的原因是抗体质量差或试剂过期所致，而且还会出现一个自由流动白色粉末、持续性团块等，这表表明试剂已被污染。

问：胶乳溶液用什么缓冲液多大离子强度保存稳定性最好？

答：一般常用的是低浓度的Goods缓冲液，如MOPSO、MES、HEPES等缓冲液，浓度在25-50mmol/L。

问：胶乳微球偶联抗体后与抗原进行反应，但是反应不明显，是什么原因所致？

答：⑴抗原和抗体不匹配；⑵包被的抗体量下足；⑶抗体使用量虽多，但偶联效率低。

问：如何选择胶乳试剂的波长？

答：胶乳试剂随着检测波长的增加吸光度降低，为了保证试剂检测过程中不超过吸光度的检测限，一般胶乳试剂的波长选择在546-600nm左右。

微球表面基团种类及其反应

共价结合胶乳微球的参考方法（以下内容均为国外文献翻译过来的）

A. 一步法

1. 配制50 mM 的MES反应缓冲溶液，pH值为6.0；

2. 将蛋白质溶解于反应缓冲溶液中，其浓度为10mg/ml；

3. 用反应缓冲溶液稀释胶乳微球，使其浓度为1%（W/V）；

4. 将上述蛋白质溶液与胶乳微球混和，混和后在室温培育20分钟；

5. 用去离子水配制EDAC溶液，浓度为10 mg/ml（52μmol/ml）；

6. 取计算量的EDAC溶液加到蛋白质与胶乳微球混合液中；

7. 用0.1 M氢氧化钠（NaOH）溶液调整该反应混合液的pH值至 6.5±0.2，在摇床室温培育2小时；

8. 将未结合的蛋白质除去，贮藏于缓冲溶液中。

B. 二步法

简单二步法

1. 用反应缓冲溶液稀释胶乳微球，使其浓度为1%（W/V）；

2.1ml胶乳微球悬浮液，加入20 mg EDAC，在室温培育40分钟，在20分钟后第二次加入20 mg/ml；

3.用相等体积的该缓冲溶液来洗涤胶乳微球，离心，用1倍体积的缓冲溶液重复处理；

4.将蛋白质溶解于50-100mM的MES缓冲溶液中，蛋白质浓度为1mg/ml；

5.再将胶乳微球悬浮于去离子水或结合的缓冲溶液中，迅速加入溶解的蛋白质，37℃搅拌反应3小时；

6.按1ml反应混合液加入2.5 μl乙醇胺混合，搅拌反应10分钟；

7.除去未结合的蛋白质，贮藏与贮存的缓冲溶液中。

生成NHS-酯的中间体二步法

1.每ml反应混合物加入下列各物：

a.去离子水是最后容积为1.0 ml；

b.0.1 ml的10x的贮备缓冲溶液，其pH值为6.0-6.5（一般可用0.5 M MES缓冲溶液）；

胶乳微球最终浓度为1%（W/V）；

c.0.23 ml的50 mg/ml 的NHS在去离子水中的溶液；

d.19.2 mg/ml (100 mM)的EDAC在去离子水中的溶液（注5、6）；

2.在室温将此混合物反应15-30分钟，不断搅拌；

3.用MES缓冲液或纯化水洗涤胶乳微球悬浮物，除去未反应的NHS和EDAC；

4.重新将胶乳微球在去离子水中悬浮，使其浓度为1%（w/v）；

5.将结合的蛋白质溶于50-100mM 的MES缓冲溶液中，浓度为1 mg/ml；

6.立即加入蛋白质溶液（胶乳微球、蛋白质和缓冲溶液的浓度分别为0.5%(w/v)、0.5 mg/ml、25-50 mM）；

7.将混合物反应至少2小时，轻轻搅拌；

8. 按1ml反应混合液加入2.5 μl乙醇胺混合，搅拌反应10分钟；

9.除去未结合的蛋白质和乙醇胺，贮与适宜的贮存缓冲溶液中。

C、蛋白质与带醛基的胶乳微球反应

带醛基的胶乳微球是疏水性的胶乳微球，能吸附并能与蛋白质在中性pH条件下生成Schiff碱，这是脂肪族醛基与蛋白质的氨基发生的反应（赖氨酸的伯胺）。这些胶乳微球不需事先活化而生成共价链。Schiff碱的生成是可逆反应。此Schiff碱能被氰基氢硼化钠（sodium cyanoborohydride）反应还原至稳定的烷基胺。当肽类或其他有单一反应氨基的分子与带醛基的胶乳微球结合时，由于还原而趋向稳定。

下面说明蛋白质与带醛基的胶乳微球结合的方法：

1. 配制50 mM的反应缓冲溶液，pH值为7.0-7.5；

2. 配制10 mg/ml的蛋白质在反应缓冲溶液中的溶液；

3. 配制1%(w/v) 带醛基胶乳微球在反应缓冲溶液中的悬浮液；

4. 将1份蛋白质溶液和10份胶乳微球悬浮液混和，在室温反应2小时；

5. 除去未结合的蛋白质；

6. 贮藏胶乳微球结和物与适宜的贮存缓冲溶液中。