1. 探针的标记：

(1) 如下设置探针标记的反应体系：待标记探针 (1.75pmol/微升) 2微升T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) 1微升Nuclease-Free Water 5微升[γ-32P]ATP(3，000Ci/mmol at 10mCi/ml) 1微升T4 Polynucleotide Kinase (5-10u/微升) 1微升总体积 10微升

按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。

(2) 使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。

(3) 加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。

(4) 再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上标 记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。

(5) 标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。

2. 探针的纯化：

通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如 下步骤操作：

(1) 对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5M醋酸铵，再加入2体积即200微升的无水乙醇，混匀。

(2) 在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。

(3) 在4℃，12, 000g-16, 000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉。

(4) 在4℃，12, 000g-16, 000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。

(5) 加入100微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在 -20℃。

3. EMSA 胶的配制：

(1) 准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。

(2) 按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29：1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。TBE buffer (10X) 1毫升重蒸水 16.2毫升39：1 acrylamide/bisacrylamide (40%，w/v) 2毫升80% 甘油 625微升10% 过硫酸铵 (ammonium persulfate) 150微升TEMED 10微升

(3) 按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡， 并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。

4. EMSA结合反应：

(1) 如下设置EMSA结合反应(预期的结果参见图1)：

(2) 按照上述顺序依次加入各种试剂,在加入标记好的探针前先混匀,并且室温(20-25℃)放置10分钟,从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合,或者让冷探针优先反应.然后加入标记好的探针,混匀,室温(20-25℃)放置20分钟.

(3)加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色,10X),混匀后立即上样.注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合,建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液.如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样,可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液,至能观察到蓝颜色即可.

5. 电泳分析：EMSA的典型分析结果可以参见下面的图1.

图1. 一个典型的EMSA/Gel-Shift分析图

1,阴性对照反应(标记探针);2,常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针);3,探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+标记探针100倍量的未标记探针);4,突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+标记探针100倍量的未标记突变探针);5,Super-shift反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+目的转录因子的特异抗体).

(1) 用0.5XTBE作为电泳液.按照10V/厘米的电压预电泳10分钟.预电泳的时候如果有空余的上样孔,可以加入少量稀释好的1X 的EMSA上样缓冲液(蓝色),以观察电压是否正常进行.

(2) 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内.在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液 (蓝色),用于观察电泳进行的情况.

(3) 按照10V/厘米的电压电泳.确保胶的温度不超过30℃,如果温度升高,需要适当降低电压.电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓 冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处,停止电泳.

(4) 剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸.小心取下夹有EMSA胶的胶板,用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边缘的电压液.小心打开两块胶板中的上面一块(注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板),把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶,轻轻把滤纸和胶压紧.滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟),轻轻揭起滤纸,这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来.把滤纸侧向下,放平,在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜,确保保鲜膜和胶之间没有气泡.

(5) 干胶仪器上干燥EMSA胶.然后用X光片压片检测,或用其它适当仪器设备检测.