取材及胶质细胞的混合培养

1.P2 SD大鼠经低温麻醉后以碘酒和75％乙醇消毒，无菌操作下，断头放入预冷的D-Hanks液中，在解剖显微镜下取大脑皮层并除去脑膜。

2. 剪碎组织成1mm3大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱内消化20min，中间摇晃一次。

3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的MEM＋10％FBS（Glial Medium，GM）的离心管内终止消化液作用5min。

4.吸出组织转移到另一支装有冷的GM的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清并吸到另一支离心管内。重复上述步骤2～3次。

5.所得上清于800r/min离心5min，弃上清，管内加入新鲜GM并吹打成单细胞悬液。细胞计数，调整细胞密度按1.5×10⁵/cm²种入25cm²培养瓶，放入孵箱培养。以后每隔2～3d进行全量换液。

摇床振摇分离星形胶质细胞和寡突胶质细胞

培养至7～10天，换液后放入孵箱继续培养24h，取出拧紧培养瓶盖，于37℃恒温摇床上280r/min摇动18h。此时寡突胶质细胞90％以上在培养悬液内而与瓶底贴壁的星形胶质细胞分离。

分离培养悬液内的寡突胶质细胞

吸出悬液至离心管内950r/min离心10min，弃上清后管内加入新鲜GM，吹打成单细胞悬液，按1.5×10⁵/cm²种入预先用100μg/L多聚赖氨酸包被好的35mm培养皿培养。24h后换成DF12＋N2的无血清培养液，此后每三天半量换液1次。

瓶底星形胶质细胞的继续培养

25cm²培养瓶内的星形胶质细胞用D-Hanks液洗2次后常规传代，以1.5×10⁵/cm²种入预先用100μg/L多聚赖氨酸包被好的35mm培养皿培养。培养液为GM，每三天半量换液1次。