1.麻醉后消毒,下腹正中切口于膀胱颈(结扎处远端约1~2cm)
2. 严格无菌操作取出标本、手术台位于超净台旁
3.在超净台,40u/ml庆大霉素溶液中浸泡5分钟
4.生理盐水漂洗1次
5.D-hanks液漂洗1次
6.放入D-hanks液中,除去粘膜、粘膜下及浆膜
如果是Shame组兔,以10ml注射器抽取约8ml D-hanks液,于粘膜层下注射起泡后,剪去粘膜层,直接剪取平滑肌组织,弃浆膜层及其上未剪下之肌组织。
new: 如果是不全BOO兔,则可将膀胱剪成宽约0.5cm之条状,撕去粘膜层后,助手以一眼科镊将该组织一端固定,眼科镊与该组织垂直,并夹持整个横截面,术者同法夹持于附近,助手持第3把眼科镊提起肌组织,术者以手术刀锐性分离肌层;如此,向另一端推进,锐性分离肌条。
7.在超净台,取相当于0.5为X0.5 CM2肌块,室温下将其剪碎成1~2mm碎组织块 8.转移入离心管
9.加入D-hanks液(操作成功) OR Dulbecco
10.离心1000转/min,10分钟 离心半径13cm,弃上清
11.加入I型胶原酶(2mg/ml) 5mg,(II型胶原酶2mg/ml 5mg也可,但效果不如I型胶原酶)
12.不要加入DMEM为主要成分的培养液(否则胰蛋白酶失活)
13.转移入培养瓶中
14.4度下过夜孵育。
15.加0.25%胰蛋白酶
16.36.5度振荡消化15~30min,弃上清。(可省)
17.200目(74um)不锈钢网过滤。(可省)
18.转移入离心管,吹打后待可见物沉淀,吸尽沉淀(避免组织块培养法)
19.离心1000转/min,10分钟 离心半径13cm,弃上清
20.加培养液至10ml(ok)
21.转移入培养瓶中
2 2.CO2恒温箱中培养
23.12h后收集未贴壁细胞并计数 |