1．材料

1.1 10-12日龄非免疫受精鸭胚 购于雅安偏远山区

1 .2标准胎牛血清(FBS) Tianjin.h&y bio.co;ltd

1.3MEM营养液（细胞增殖液；细胞维持液；洗液） GIBCO Invitrogen Corporation

1.410倍胰酶 （自配）

1.5抗生素 医用80万单位青霉素和医用100万单位链霉素

1.6灭菌的无钙、镁平衡盐溶液（自配）

2．实验器材与仪器

2.1实验器材

国产玻璃螺旋口细胞培养瓶（100ml）；培养皿；离心管（10ml）移液管（10ml与1ml）；漏斗；10层纱布；三角锥瓶（100ml）；吸耳；酒精灯；酒精（75%）；碘酒(3%)；火柴；瓶塞；镊子；滤器及配套滤膜（25mm直径 孔径0.22um）；50ml注射器；烧杯；蛋座；记号笔；离心管架；金属饭盒；照蛋器。

2.2 实验仪器

仪器名称  产地

超纯水仪  Water pro ps.labconco

电子天平  ShangpingFA2004. 上海天平仪器厂

高压灭菌仪  HIRAYAMA4

双蒸水仪  上海亚荣生化仪器厂

Orion台式PH测试仪  868型 OrionResearch.Inc

倒置显微镜  OLYMPUS

细胞培养箱  Queue

台式高速低温离心机  Beckman coultertm

超净台  苏州安泰空气技术有限公司

水浴锅  国华电器有限公司

低温冰箱  海尔集团

电热恒温鼓风干燥箱  DHG-9140型上海精宏实验设备有限公司

3.4 原代鸭胚成纤维细胞的制备。（10×ATV消化法）

实验前，无菌室用紫外线照射30min以上；超净台使用前应彻底擦干再用0.1%苯扎溴铵（新洁尔灭）擦拭一遍 。双手和瓶子表面用75%的酒精消毒。(以下步骤参考文献[2][4][5][6]进行的)

①取10-12日龄发育良好的鸭胚，气室向上置于蛋盘内，用碘酒擦拭鸭蛋表面，后用酒精脱碘，并在气室端打一小孔，沿气室用镊子小心剪去蛋壳露出气囊，以镊子去除覆盖于绒毛尿囊摸上的白膜，暴露出尿囊膜及附着的血管。用镊子撕开尿囊膜，夹住鸭胚颈部，移置于一小培养皿中。

②去除胚的头，四肢和内脏，用基础营养液清洗2-3次，直至组织出现透明，倒尽清洗液。

③用眼科剪剪碎胚体直至0.1-0.5立方毫米 。剪越碎越好。

④移组织碎块于三角锥瓶内，加0.2ml/胚 的10×ATV 37℃水浴锅内温 热消化 2min，后用吸管移至离心管中,用离心机5000rpm 离心5min弃上清液。

⑤加入含双抗的10%血清的基础营养液，移离心管下层组织碎块于三角锥瓶内，由于分散的细胞在没有胰蛋白酶的作用下，会很快聚合成小团，为减少细胞成团应不断吹打，直至成细胞全部分散开。

⑥取灭菌纱布叠成8-10层置于漏斗上并使中部略凹陷，以含双抗的10%的基础营养液润湿纱布，将已吹散的细胞悬液经纱布过滤除杂。

⑦过滤后的细胞悬液补加含有双抗的10%血清的基础营养液，按10ml装入细胞培养瓶（容量为150ml的细胞瓶），将细胞瓶置于37℃细胞培养箱内静置培养 。2小时后观察细胞贴壁情况，24小时后确认无污染。一般情况，24小时后细胞可基本长成单层。