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大鼠胰岛细胞原代培养
发布日期:2012-12-23      浏览:2032

一周龄Wistar大鼠,断颈处死,于75%乙醇浸泡15分钟,无菌取出胰脏,于冰冷无菌D-Hanks液中漂洗,用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织,转入青霉素小瓶中,加入少量无菌D-Hanks液,用眼科剪剪成0.1-1.0mm3大小的碎片,用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴,再用无菌D-Hanks液反复清洗8~10次,加入10倍体积无菌消化酶液[胰蛋白酶-胶原酶消化液:0.05g胰蛋白酶(Sigma),0.025g Ⅴ型胶原酶(Sigma,663U/mg),0.05g葡萄糖,溶于100 mL无Ca2+、Mg2+的0.01mol/LPBS(pH值为7.4)溶液,用0.22μm微孔滤膜滤菌],38℃±1℃消化,消化过程中不断震荡,10分钟后吸出上面酶液弃去,用无菌D-Hanks液将组织块清洗2~3次,加入新鲜酶液继续消化,重复上述步骤。此时组织块边缘模糊,再将组织块浸入消化酶液中,38℃±1℃消化10分钟,将消化酶液与组织块分开,组织块重新加入新鲜消化酶液进行消化;而原消化酶液1500rpm离心10分钟,取沉淀即为消化下的细胞,重新用无菌D-Hanks悬浮,离心,重复1~2次,再用培养基洗2~3次,用培养基悬浮即得细胞悬液;将消化过的组织块重复消化5~6次至组织块消化完全,重复以上操作,合并几次所得细胞悬液,计数,调整细胞浓度为2×105个细胞/mL,将细胞悬液接种于24孔塑料培养板中,每孔1mL,置于37℃,5%CO2,饱和湿度培养箱中培养。由于成纤维细胞贴壁要比胰岛细胞迅速,接种15小时后,轻轻振荡培养板,将上面未贴壁的细胞接入新的培养板中,可除去部分成纤维细胞。将新培养板中细胞培养48小时后,换新鲜配置的含有2.5ng/mL的碘乙酸的培养基培养5小时,可除去绝大部分成纤维细胞,而胰岛细胞不受伤害,换不含碘乙酸的培养基洗2次,并换不含碘乙酸的培养基在37℃,5%CO2,饱和湿度培养箱中培养,每隔3天换培养液,获得单层胰岛细胞。

 
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