材料和方法

1.仪器：

手术器械一套，倒置显微镜（Leica）,CO2细胞孵育箱（Heraeus），超净工作台（苏州净化设备有限公司），扫描电子显微镜（Hitachi）。

2.主要试剂

DMEM高糖培养基（Gibco），胎牛血清（Hyclone，杭州四季青生物工程材料公司），胰蛋白酶、EDTA（Ameresco）；小鼠抗人CD105单克隆抗体（NeoMarkers），兔抗人CD34、CD31多克隆抗体（Antibody Diagnostica Inc），兔抗人vW因子多克隆抗体（华美公司），抗兔及抗鼠ABC试剂盒、DAB显色试剂盒为华美公司产品，其他试剂均为国产分析纯以上级别。

3.方法

3.1 植块法原代细胞培养[1]：

细胞培养瓶的处理[2]：选用50ml玻璃培养瓶，高压蒸汽灭菌，瓶底铺自制鼠尾胶（制作方法参见2），移入80℃烤箱烤干，临用前用消毒D-Hanks平衡盐缓冲液冲洗3次。

选用80克SD大鼠（雌雄不限，购自复旦大学实验动物部），1%戊巴比妥钠（1ml/100g）腹腔注射麻醉，75%酒精浸泡5min消毒，将大鼠移至超净台进行操作，止血钳固定四肢，逐层打开胸腔，暴露心脏，剪开心包，由升主动脉处剪下心脏，放入D-Hanks平衡盐缓冲液中，冲净心腔中的血液，辨清心脏解剖结构，去除大血管、左右心房以及右心室和室间隔，保留左心室，小心去除心内膜及心外膜，用眼科剪剪碎余下的心室肌约2mm见方，滴加1ml进口胎牛血清，均匀接种于处理过的50ml培养瓶中，放入37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞孵育箱静置培养，使其贴壁，4小时后追加20%胎牛血清的DMEM高糖培养液4.5ml/瓶，约48小时后组织块周围有星形细胞长出，80至96小时组织块周围有大量细胞长出，去除组织块，继续培养36-48小时，待细胞汇合铺满瓶底后用含0.125%胰蛋白酶、0.02%EDTA的消化液消化细胞进行传代，取用第二代细胞进行进一步鉴定和实验。

（五）观察。接种6-12h，开始贴壁，并有集合现象，细胞生长突起明显，5-7d胶质细胞增生明显，7-10d胶质细胞成片于神经细胞下面，形成地毯，2周时神经细胞生长最丰满，四周晕光明显，一个月后，有些神经细胞开始退化，变形，甚至出现空泡，一般培养2-4周最宜。

但神经细胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能传代，不会有细胞周期，而且随培养时间的延长，细胞数量在下降，但胶质细胞可以，神经胶质细胞也可以。在培养过程中，早期9-12d时，有较多的神经细胞死亡，这是第一次死亡阶段，应注意保持条件的恒定。在此之后存活下去的细胞一般突起长而多，且相互形成突触。